Pulex - Cosmic Silence

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Introduzione

Il ruolo dei laboratori sotterranei come infrastruttura di ricerca sugli effetti dell’esposizione a basse dosi/ratei di dose di radiazioni ionizzanti

Nel corso di miliardi di anni la vita sulla Terra si è sviluppata in condizioni ambientali che comprendevano la presenza di radiazioni ionizzanti di provenienza spaziale e terrestre. Tutti gli organismi viventi si sono quindi evoluti in presenza di radiazione ambientale, rappresentata dai raggi cosmici e dagli isotopi radioattivi della Terra, e con essa si confrontano costantemente. Comprendere se e come la radiazione di fondo ambientale influenzi il metabolismo degli esseri viventi è quindi un aspetto di estrema rilevanza negli studi di radiobiologia delle basse dosi. Una comprensione più approfondita della risposta biologica alla radiazione di fondo ambientale è importante non solo per migliorare la conoscenza dell’evoluzione della vita ma anche per definire la validità degli attuali modelli radioprotezionistici alle basse dosi che sono quelle con cui ci confrontiamo ogni giorno della nostra vita.

A tali fini, utili informazioni possono essere ottenute mediante un approccio che analizza differenze tra sistemi biologici mantenuti in parallelo sia in condizioni di fondo di radiazione ambientale di riferimento (Reference Radiation Environment, RRE) che in condizioni di fondo di radiazione ambientale fortemente ridotto (Low Radiation Environment, LRE). Per questo tipo di sperimentazione le infrastrutture di ricerca svolgono un ruolo fondamentale e facility sotterranee come quella dei Laboratori Nazionali del Gran Sasso (LNGS) dell’INFN rappresentano un’opportunità unica, essendo il flusso di raggi cosmici ridotto di un fattore 106 e quello di neutroni di un fattore 103 rispetto all’ambiente esterno (https://www.lngs.infn.it/en/lngs-overview).

Gli esperimenti denominati PULEX, condotti ai LNGS a partire dalla metà degli anni ’90, su cellule di diversa origine (lievito, roditore, uomo) hanno mostrato che la radiazione ambientale può agire come stimolo per innescare meccanismi di difesa rispetto ad un danno genotossico. Cellule cresciute in condizioni di riferimento sono infatti più resistenti rispetto a cellule cresciute in un ambiente con fondo di radiazioni fortemente ridotto. Gli esperimenti condotti nell’ambito di COSMIC SILENCE, attualmente in corso, hanno lo scopo di approfondire lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella risposta biologica alla radiazione ambientale in sistemi modello, sia in vitro che in vivo, a diversi livelli nella scala filogenetica. In questo ambito rientra il progetto FLYINGLOW, lanciato nel 2016 con un iniziale finanziamento da parte del Centro Fermi, che ha previsto l’utilizzo del moscerino della frutta Drosophila melanogaster come organismo modello. Uomo e Drosophila presentano un’elevata omologia, sia a livello molecolare che genetico: circa il 75% dei geni noti coinvolti in malattie umane ha infatti un omologo in Drosophila, e questa viene utilizzata ormai da più di un secolo come organismo di elezione in studi di radiobiologia.

L’esperimento RENOIR, recentemente finanziato dalla CSN5 dell’INFN, si propone di comprendere se le differenti risposte biologiche osservate in LRE rispetto a RRE sono determinate da un incremento generale del rateo di dose o piuttosto dal contributo di specifiche componenti del campo di radiazione ambientale [18].


Descrizione

Vari studi hanno cercato di valutare l’influenza della radiazione ambientale sulla materia vivente ed hanno messo in luce come condizioni di basso fondo di radiazioni possano influenzare il metabolismo cellulare. Nel 1995, sfruttando l’opportunità rappresentata dai LNGS, Luigi Satta e collaboratori hanno effettuato esperimenti volti allo studio della modulazione del potenziale mutagenico di agenti chimici in cellule di lievito mantenute per 120 generazioni in condizioni di radiazione ambientale di riferimento presso l’Università La Sapienza di Roma (RRE) ed estremamente ridotte nei laboratori sotterranei dei LNGS (LRE). I risultati ottenuti hanno mostrato che la permanenza in LRE diminuisce i meccanismi di difesa del lievito Saccharomyces cerevisiae nei confronti di composti chimici radio-mimetici [1].
Da allora, nell’ambito di una collaborazione più estesa, una serie di studi radiobiologici sono stati condotti nell’ambiente sotterraneo dei LNGS. Gli esperimenti PULEX hanno approfondito lo studio in vitro dell’influenza della radiazione ambientale sul metabolismo e sui meccanismi di risposta allo stress ossidativo di colture di cellule di roditore ed umane mantenute in parallelo, per un numero di generazioni confrontabile a quello dei lieviti, in diverse condizioni di fondo ambientale di radiazione [2-4].

Complessivamente, i dati ottenuti hanno mostrato che, così come per i lieviti, cellule di mammifero mantenute in condizioni di fondo di radiazione estremamente ridotto mostrano un diverso comportamento biochimico rispetto a cellule mantenute nell’ambiente di riferimento. In particolare, cellule coltivate nei laboratori sotterranei del Gran Sasso sono meno protette nei confronti del danno al DNA provocato da agenti chimici e fisici e mostrano una ridotta capacità di cattura di specie reattive dell’ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) rispetto a cellule coltivate nel laboratorio di riferimento, ad es. quello presso l’Istituto Superiore di Sanità (ISS), Roma.

Le attività di COSMIC SILENCE sono partite più di recente con lo scopo di continuare ad approfondire il ruolo giocato dalla radiazione ambientale nella risposta di sistemi biologici e, nello specifico, di studiare i meccanismi molecolari coinvolti in tale risposta utilizzando altri sistemi modello in vitro (e.g. cellule di ibridoma A11, derivate dal topo transgenico pKZ1) [5] e di estendere la sperimentazione a studi in vivo su sistemi modello con differenti livelli di complessità filogenetica a partire dal moscerino della frutta Drosophila melanogaster [9-14].

I risultati ottenuti finora utilizzando cellule A11 (gentilmente donate da P.Sykes, Flinders University, Adelaide, Australia) mantenute in coltura per 1 mese sia nel laboratorio sotterraneo dei LNGS che nel laboratorio di riferimento all’ISS hanno rafforzato l’ipotesi che la radiazione ambientale possa contribuire allo sviluppo ed al mantenimento di meccanismi di difesa contro lo stress ossidativo. Inoltre, esperimenti mirati allo studio dell’espressione di alcuni geni coinvolti in questo tipo di risposta hanno mostrato che la presenza o assenza di una schermatura di 5 cm di ferro (in grado di ridurre la componente gamma dello spettro di radiazione di un fattore ≈4) non modifica in maniera significativa l’espressione genica in cellule mantenute in LRE [17].

Per approfondire questo aspetto sono in corso esperimenti in collaborazione con J.B. Smith e collaboratori (University of New Mexico, NM, USA) volti ad aumentare il livello di fondo gamma in LRE utilizzando sorgenti naturali di radiazione. Questi ricercatori, utilizzando cellule di mammifero e batteri cresciuti in condizioni di basso fondo ambientale nel laboratorio allestito presso il Waste Isolation Pilot Plant (WIPP), USA, hanno ottenuto evidenze sperimentali in accordo con quelle ottenute ai LNGS [6,7].

Per poter condurre studi su organismi multicellulari, nel laboratorio sotterraneo è stata realizzata una nuova facility dedicata alla sperimentazione in vivo. Questa facility, denominata COSMIC SILENCE, allestita accanto alla facility PULEX per colture cellulari, è fornita di sistemi di controllo di temperatura, umidità e luce oltre che di un sistema indipendente di ventilazione [8].

Gli esperimenti condotti nell’ambito del progetto FLYINGLOW si sono focalizzati al mantenimento di ceppi selvatici e mutanti nei sistemi di riparazione del DNA di Drosophila in parallelo sia nella facility COSMIC SILENCE che nei laboratori di riferimento esterni presso l’Università degli Studi dell’Aquila. Sono stati valutati parametri vitali quali la lunghezza della vita media, la fertilità e la motilità dei moscerini ed è stata confrontata l’efficienza dei sistemi di riparazione del DNA. Questi studi hanno messo in evidenza che lo sviluppo di Drosophila, così come la sua risposta a stress genotossici, risultano alterati nei moscerini cresciuti in un ambiente a fondo di radiazioni fortemente ridotto rispetto a quelli cresciuti in un ambiente di riferimento [15,16]. Questi risultati, perfettamente in accordo con i precedenti ottenuti in vitro, rappresentano la prima evidenza sperimentale dell’influenza della radiazione ambientale in un organismo complesso, fornendo un contributo importante sia dal punto di vista radioprotezionistico che per la comprensione dell’influenza che la naturale radiazione di fondo sulla Terra ha avuto nell’evoluzione degli esseri viventi.

Il più recente esperimento RENOIR si propone di investigare il contributo delle i differenti componenti del campo di radiazione nel determinare gli effetti biologici ottenuti nei precedenti esperimenti condotti in Drosophila melanogaster. A tal fine, RENOIR si pone due principali obiettivi:

  1. migliorare la conoscenza del campo di radiazione nei due siti sperimentali RRE e LRE;
  2. ottenere informazioni sul coinvolgimento della componente gamma del campo di radiazione ambientale sulla fertilità e sulla modulazione dell’espressione genica nei moscerini.

L’esperimento RENOIR prevede, in primo luogo, una nuova campagna di caratterizzazione del campo di radiazione sia in LRE che in RRE. La componente gamma verrà indagata attraverso misure semi-quantitative spettroscopiche utilizzando uno spettrometro (80%HpGe) portatile ad alta efficienza. Attraverso questa tecnica, verrà elaborato uno spettro gamma utile ad ottenere informazioni circa il flusso dei raggi gamma nei siti sperimentali. Inoltre il rateo di dose gamma verrà misurato sia a RRE che a LRE, attraverso scintillatori organici e rivelatori a termoluminescenza ad alta sensibilità (TLD-700H).

Per quanto riguarda la componente neutronica il rateo di dose dovuto ai neutroni termici verrà determinato sottraendo il valore ottenuto con TLD-600H, che misurano la somma dei ratei di dose gamma e di neutroni termici (avendo un notevole assorbimento nel range dei neutroni termici) dal valore ottenuto con TLD-700H, che misurano il solo rateo di dose gamma. Inoltre, al fine di effettuare misurazioni in un range più ampio di energia del campo neutronico, utilizzeremo un tubo proporzionale a gas BF3, nello specifico un rilevatore a trifluoruro di Boro (Centronic) e uno spettrometro real-time DIAMON sviluppato dal  laboratorio di Misure Nucleari del Dipartimento di Energia del PoliMI in Italia in collaborazione con RAYLAB [19].

Verranno inoltre condotte delle simulazioni Monte Carlo al fine di caratterizzare anche quella parte di campo di radiazione ambientale non direttamente rivelabile dagli strumenti a nostra disposizione, ad esempio la componente muonica, e per ottenere un appropriato modello di dose nei due siti sperimentali LRE e RRE. Le simulazioni saranno inoltre utili nella progettazione e realizzazione dei dispositivi che utilizzeremo per ridurre o incrementare il rateo di dose dei raggi gamma rispetto a quello ambientale. La modulazione della componente gamma del campo radioattivo infatti rappresenta uno dei principali obiettivi di RENOIR.

Al fine di ridurre sensibilmente la componente ambientale gamma a RRE, adatteremo ai nostri scopi una schermatura in Pb in uso per la spettroscopia gamma. Tale cilindro cavo dello spessore di 10 cm verrà fornito di un sistema di ventilazione per evitare accumuli di radon al suo interno e da un sistema di controllo della temperatura e della luce per permettere una crescita ottimale delle colture di Drosophila al suo interno.

 Schermatura websiteSchermatura in pb

Per incrementare la componente ambientale gamma a in LRE, utilizzeremo un ‘Marinelli beaker’ appositamente progettato e realizzato per i nostri scopi. Esso verrà riempito con materiali da costruzione emettitori naturali di raggi gamma, quali tufo e pozzolana, e verrà sigillato ermeticamente per evitare l’esposizione al radon ambientale.

Marinelli websiteEsempio di ‘Marinelli beaker’ standard

Partendo quindi da un valore misurato nel laboratorio sotterraneo, LRE, di circa 20nGy/h per i raggi gamma, che rappresenta l’unica componente a basso LET in questo ambiente, gradualmente aumenteremo tale contributo fino a raggiungere un valore pari (e anche superiore) al rateo di dose totale delle componenti a basso LET (gamma e muoni) presenti nel laboratorio esterno (RRE).

La radioattività intrinseca al nostro apparato sperimentale (tubi e tappi per la crescita dei moscerini, terreno di crescita e le stesse Drosophile ) e il contributo in rateo di dose da essa determinato verrà misurato attraverso due tecniche l’ICP-MS (spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente) e attraverso la spettroscopia gamma utilizzando rivelatori di Ge ultrapuro in collaborazione rispettivamente con i colleghi di Chimica e Impianti Chimici e di Tecniche Speciali dei LNGS.

Inoltre, stiamo conducendo dei test di fertilità sia a RRE che a LRE con lo scopo di valutare se la riduzione del livello di radon ambientale, ottenuto grazie ad un miglioramento del sistema di areazione nel lab sotterraneo, ha una qualche influenza sui nostri precedenti risultati. Stiamo anche studiando la selezione positiva di uno specifico mutante della risposta al danno al DNA che risulta inaspettatamente favorito in condizione di RRE, come precedentemente descritto (15).

Per comprendere il meccanismo molecolare alla base degli effetti biologici che abbiamo osservato verrà condotta un’analisi comparativa dell’intero trascrittoma mediante RNA-Seq, una tecnica di sequenziamento di ultima generazione.

Attualmente, queste attività sono svolte nell'ambito della “Convenzione operativa per le attività di ricerca e sviluppo nel campo della radiobiologia” tra INFN e ISS, come previsto nell’Accordo Quadro tra i due Enti.

 

Responsabili del progetto
Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo. (INFN Roma 1)
Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo. (Istituto Superiore di Sanità, INFN Roma 1)
Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo. (INFN-LNGS)



Collaborazione

  1. Istituto Superiore di Sanità (Centro nazionale tecnologie innovative in sanità pubblica; Centro nazionale protezione dalle Radiazioni e fisica computazionale; Servizio grandi strumentazioni e core facility) and INFN-Sezione di Roma 1
  2. INFN - LNGS (Divisione Ricerca; Servizio di Chimica e Impianti Chimici)
  3. INFN - LNF (Servizi tecnici della Fisica Sanitaria)
  4. Department of Clinical and Biotechnological Sciences,  L’Aquila University
  5. Department of Biology & Biotechnology “C. Darwin”, Section of Genetics, “La Sapienza” University, Rome
  6. Radon laboratory of Istituto Nazionale di Metrologia delle Radiazioni Ionizzanti (INMRI) of Ente nazionale per le nuove tecnologie, l’energia e lo sviluppo economico sostenibile (ENEA)
Altre collaborazioni
  • New Mexico State University and WIPP Facility, underground repository, New Mexico, USA
  • Flinders University, Adelaide, Australia



Pubblicazioni

  1. Satta L, Augusti-Tocco G, Ceccarelli R, Esposito A, Fiore M, Paggi P, Poggesi I, Ricordy R, Scarsella G, Cundari E (1995). Low environmental radiation background impairs biological defence of the yeast Saccharomyces cerevisiae to chemical radiomimetic agents. Mutat Res 347(3-4):129-33.
  2. Satta L, Antonelli F, Belli M, Sapora O, Simone G, Sorrentino E, Tabocchini MA, Amicarelli F, Ara C, Cerù MP, Colafarina S, Conti Devirgiliis L, De Marco A, Balata M, Falgiani A, Nisi S (2002). Influence of a low background radiation environment on biochemical and biological responses in V79 cells. Radiat Environ Biophys.
  3. Carbone MC, Pinto M, Antonelli F, Amicarelli F, Balata M, Belli M, Conti Devirgiliis L, Ioannucci L, Nisi S, Sapora O, et al. (2009). The Cosmic Silence Experiment: on the putative adaptive role of environmental ionizing radiation. Radiat. Environ. Biophys. 48:189-196.
  4. Fratini E, Carbone C, Capece D, Esposito G, Simone G, Tabocchini MA, Tomasi M, Belli M, Satta L (2015). Low radiation environment affects the development of protection mechanisms in V79 cells. Radiation Environmental Biophysics.
  5. Capece D and Fratini E (2012) The use of pKZ1 mouse chromosomal inversion assay to study biological effects of environmental background radiation. Eur. Phys. J. Plus 127: 37.
  6. Smith GB, Grof Y, Navarrette A and Guilmette RA (2011). Exploring biological effects of low level radiation from the other side of background. Health Phys.
  7. Castillo H, Schoderbek D, Dulal S, Escobar G, Wood J, Nelson R, Smith G (2015). Stress induction in the bacteria Shewanella oneidensis and Deinococcus radiodurans in response to below-background ionizing radiation. Int. J. Radiat Biol.
  8. Tabocchini MA (2015). PULEX-COSMIC SILENCE Extremely low radiation background facilities at INFN-LNGS. AIR² Bullettin, Issue 3, December 2015 (http://www.concert-h2020.eu/en/Concert_info/Access_Infrastructures).
  9. Vernì F, Cenci G (2015). The Drosophila histone variant H2A.V works in concert with HP1 to promote kinetochore-driven microtubule formation. Cell Cycle.
  10. Cenci G, Ciapponi L, Marzullo M, Raffa GD, Morciano P, Raimondo D, Burla R, Saggio I, Gatti G. (2015). The analysis of pendolino (peo) mutants reveals differences in the fusigenic potential among Drosophila telomeres. PLOS Genetics.
  11. Sudmeier LJ, Howard SP, Ganetzky B (2015). A Drosophila model to investigate the neurotoxic side effects of radiation exposure. Dis Model Mech.
  12. Morciano P, Zhang Y, Cenci G, Rong YS (2013). A hypomorphic mutation reveals a stringent requirement for the ATM checkpoint protein in telomere protection during early cell division in Drosophila. G3 (Bethesda).
  13. Graziadio L, Palumbo V, Cipressa F, Williams BC, Cenci G, Gatti M, Goldberg ML, Bonaccorsi S (2018). Phenotypic characterization of diamond (dind), a Drosophila gene required for multiple aspects of cell division. Chromosoma.
  14. Di Giorgio ML, Morciano P, Bucciarelli E., Porrazzo A., Cipressa F., Saraniero S., Manzi D.,   Rong YS, Cenci G (2020). The Drosophila Citrate Lyase Is Required for Cell Division During Spermatogenesis. Cells.
  15. Morciano P, Iorio R, Iovino D, Cipressa F, Esposito G, Porrazzo A, Satta L, Alesse E, Tabocchini MA, Cenci G (2018). Effects of reduced natural background radiation on Drosophila melanogaster growth and development as revealed by the FLYINGLOW program. J Cell Physiol.
  16. Morciano P, Cipressa F, Porrazzo A, Esposito G, Tabocchini MA, Cenci G (2018). Fruit flies provide new insights in low-radiation background biology at the INFN Underground Gran Sasso National Laboratory (LNGS). Radiat Res.
  17. Fischietti M, Fratini E, Verzella D, Vecchiotti D, Capece D, Di Francesco B, Esposito G, Balata M, Ioannucci L, Sykes P, Satta L, Zazzeroni F, Tessitore A, Tabocchini MA, Alesse E (2020). Low radiation environment switches the overgrowth-induced cell apoptosis towards autophagy. Front. Public Health.
  18. Esposito G, Anello P, Ampollini M, Bortolin E, De Angelis C, D'Imperio G, Dini V, Nuccetelli C, Quattrini MC, Tomei C, Ianni A, Balata M, Carinci G, Chiti M, Frasciello O, Cenci G, Cipressa F, De Gregorio A, Porrazzo A, Tabocchini MA, Satta L, Morciano P (2020). Underground Radiobiology: A Perspective at Gran Sasso National Laboratory. Front. Public Health.
  19. Pola A, Rastelli D, Treccani M, Pasquato S, Bortot D (2020). DIAMON. A portable, real-time and direction-aware neutron spectrometer for field characterization and dosimetry. Nuclear Inst. And Methods in Physics Research, Volume 969, 21 July, 164078 (doi.org/10.1016/j.nima.2020.164078).