Pulex - Cosmic Silence

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Introduzione

Il contesto generale

L’importanza di ridurre le incertezze nella valutazione del danno dovuto a dosi basse e protratte di radiazioni ionizzanti è un argomento particolarmente sentito dalla comunità scientifica (vedi Horizon 2020-EURATOM Foster Radiation Protection programme; UNSCEAR 2012 ‘Biological Mechanisms of Radiation Actions at Low Doses’). L’approccio raccomandato prevede l’integrazione di studi epidemiologici con studi sperimentali condotti in vitro ed in vivo. Al di sotto dei 100 mSv-0.1 mSv/min non è infatti possibile basarsi su dati epidemiologici e diventa quindi fondamentale la valutazione degli effetti e la comprensione dei meccanismi radiobiologici di base al fine di stimare e prevenire i rischi per la salute umana, soprattutto quelli a lungo termine.
Ad oggi si stanno accumulando numerose evidenze sperimentali, incluse quelle ottenute in diversi laboratori sotterranei, che mettono in luce divergenze dal modello lineare senza soglia (Linear No Treshold model, LNT), ufficialmente accettato per scopi radioprotezionistici da tutte le Agenzie internazionali. I dati sono però ancora contraddittori e non in grado di supportare un solido modello alternativo. C’è quindi estrema necessità di aumentare le conoscenze sui meccanismi fisici e biologici che entrano in gioco in questi scenari di esposizione.

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 Fig.1. Rappresentazione schematica delle evidenze radiobiologiche al di sotto dei 100 mSv che mettono in evidenza risposte che si discostano dalle assunzioni del modello LNT sia in senso sopralineare che sottolineare. Per quanto riguarda i laboratori sotterranei, sono state riportate evidenze coerenti di aumento di suscettibilità allo stress a seguito di esperimenti condotti presso: ^Pyrenees Mountain, Spain; § Waste Isolation Pilot Plan (WIPP), USA; *LNGS, Italy.


Il ruolo dei laboratori sotterranei come infrastrutture di ricerca sugli effetti delle basse dosi

Nel corso di miliardi di anni la vita sulla Terra si è sviluppata in condizioni ambientali che comprendevano la presenza di radiazioni ionizzanti di provenienza spaziale e terrestre. Tutti gli organismi viventi si sono quindi evoluti in presenza di radioattività ambientale naturale, rappresentata dai raggi cosmici e dagli isotopi radioattivi della Terra, e con essa si confrontano costantemente. Comprendere se e come la radiazione di fondo ambientale influenzi il metabolismo degli esseri viventi è quindi un aspetto di estrema rilevanza negli studi di radiobiologia delle basse dosi. Utili informazioni possono essere ottenute mediante un approccio che analizza differenze tra sistemi biologici mantenuti in parallelo sia in condizioni di riferimento (Reference Radiation Environment, RRE) che in condizioni di fondo ambientale fortemente ridotto (Low Radiation Environment, LRE). Per questo tipo di sperimentazione le infrastrutture di ricerca svolgono un ruolo fondamentale e facility sotterranee come quella dei laboratori Nazionali del Gran Sasso (LNGS) dell’INFN rappresentano un’opportunità unica, essendo il flusso di raggi cosmici ridotto di un fattore 106 e quello di neutroni di un fattore 103 rispetto all’ambiente esterno (https://www.lngs.infn.it/en/lngs-overview).
Gli esperimenti denominati PULEX, condotti ai LNGS a partire dalla metà degli anni ’90, su cellule di diversa origine (lievito, roditore, uomo) hanno mostrato che la radiazione ambientale può agire come stimolo per innescare meccanismi di difesa rispetto ad un danno genotossico. Cellule cresciute in condizioni di riferimento sono infatti più resistenti rispetto a cellule cresciute in un ambiente con fondo di radiazioni fortemente ridotto. Gli esperimenti condotti nell’ambito di COSMIC SILENCE, attualmente in corso, hanno lo scopo di approfondire lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella risposta biologica alla radiazione ambientale in sistemi modello, sia in vitro che in vivo, a diversi livelli nella scala filogenetica. In questo ambito rientra il progetto FLYINGLOW, lanciato nel 2016 con un iniziale finanziamento da parte del Centro Fermi, che ha previsto l’utilizzo del moscerino della frutta Drosophila melanogaster come organismo modello. Uomo e Drosophila presentano un’elevata omologia, sia a livello molecolare che genetico: circa il 75% dei geni noti coinvolti in malattie umane ha infatti un omologo in Drosophila, e questa viene utilizzata ormai da più di un secolo come organismo di elezione in studi di radiobiologia.

 

Descrizione

Vari studi hanno cercato di valutare l’influenza della radiazione ambientale sulla materia vivente ed hanno messo in luce come condizioni di basso fondo di radiazioni possano influenzare il metabolismo cellulare. Nel 1995, sfruttando l’opportunità rappresentata dai LNGS, Luigi Satta e collaboratori hanno effettuato esperimenti volti allo studio della modulazione del potenziale mutagenico di agenti chimici in cellule di lievito mantenute per 120 generazioni in condizioni di radiazione ambientale di riferimento presso l’Università La Sapienza di Roma (RRE) ed estremamente ridotte nei laboratori sotterranei dei LNGS (LRE). I risultati ottenuti hanno mostrato che la permanenza in LRE diminuisce i meccanismi di difesa del lievito Saccharomyces cerevisiae nei confronti di composti chimici radio-mimetici [1].
Da allora, nell’ambito di una collaborazione più estesa, una serie di studi radiobiologici sono stati condotti nell’ambiente sotterraneo dei LNGS. Gli esperimenti PULEX (così chiamati in contrasto all’esperimento MACRO) hanno approfondito lo studio in vitro dell’influenza della radiazione ambientale sul metabolismo e sui meccanismi di risposta allo stress ossidativo di colture di cellule di roditore ed umane mantenute in parallelo, per un numero di generazioni confrontabile a quello dei lieviti, in diverse condizioni di fondo ambientale di radiazione [2-4].
Complessivamente, i dati ottenuti hanno mostrato che, così come per i lieviti, cellule di mammifero mantenute in condizioni di fondo di radiazione estremamente ridotto mostrano un diverso comportamento biochimico rispetto a cellule mantenute nell’ambiente di riferimento. In particolare, cellule coltivate nei laboratori sotterranei del Gran Sasso sono meno protette nei confronti del danno al DNA provocato da agenti chimici e fisici e mostrano una ridotta capacità di cattura di specie reattive dell’ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) rispetto a cellule coltivate nel laboratorio di riferimento, ad es. quello presso l’Istituto Superiore di Sanità (ISS), Roma.
Le attività di COSMIC SILENCE sono partite più di recente con lo scopo di continuare ad approfondire il ruolo giocato dalla radiazione ambientale nella risposta di sistemi biologici e, nello specifico, di studiare i meccanismi molecolari coinvolti in tale risposta utilizzando altri sistemi modello in vitro (e.g. cellule di ibridoma A11, derivate dal topo transgenico pKZ1) [5] e di estendere la sperimentazione a studi in vivo su sistemi modello con differenti livelli di complessità filogenetica a partire dal moscerino della frutta Drosophila melanogaster [9-13].
I risultati ottenuti finora utilizzando cellule A11 (gentilmente donate da P.Sykes, Flinders University, Adelaide, Australia) mantenute in coltura per 1 mese sia nel laboratorio sotterraneo dei LNGS che nel laboratorio di riferimento all’ISS hanno rafforzato l’ipotesi che la radiazione ambientale possa contribuire allo sviluppo ed al mantenimento di meccanismi di difesa contro lo stress ossidativo. Inoltre, esperimenti mirati allo studio dell’espressione di alcuni geni coinvolti in questo tipo di risposta hanno mostrato che la presenza o assenza di una schermatura di 5 cm di ferro (in grado di ridurre la componente gamma dello spettro di radiazione di un fattore ≈4 non modifica in maniera significativa l’espressione genica in cellule mantenute in LRE. Per approfondire questo aspetto sono in corso esperimenti in collaborazione con J.B. Smith e collaboratori (University of New Mexico, NM, USA) volti ad aumentare il livello di fondo gamma in LRE utilizzando sorgenti naturali di radiazione. Questi ricercatori, utilizzando cellule di mammifero e batteri cresciuti in condizioni di basso fondo ambientale nel laboratorio allestito presso il Waste Isolation Pilot Plant (WIPP), USA, hanno ottenuto evidenze sperimentali in accordo con quelle ottenute ai LNGS [6,7].

Per poter condurre studi su organismi multicellulari, nel laboratorio sotterraneo è stata realizzata una nuova facility dedicata alla sperimentazione in vivo. Questa facility, denominata COSMIC SILENCE, allestita accanto alla facility PULEX per colture cellulari, è fornita di sistemi di controllo di temperatura, umidità e luce oltre che di un sistema indipendente di ventilazione [8].
Gli esperimenti condotti nell’ambito del progetto FLYINGLOW si sono focalizzati al mantenimento di ceppi selvatici e mutanti nei sistemi di riparazione del DNA di Drosophila in parallelo sia nella facility COSMIC SILENCE che nei laboratori di riferimento esterni presso l’Università degli Studi dell’Aquila. Sono stati valutati parametri vitali quali la lunghezza della vita media, la fertilità e la motilità dei moscerini ed è stata confrontata l’efficienza dei sistemi di riparazione del DNA. Questi studi hanno messo in evidenza che lo sviluppo di Drosophila, così come la risposta a stress genotossici, risulta alterato nei moscerini cresciuti in un ambiente a fondo di radiazioni fortemente ridotto rispetto a quelli cresciuti in un ambiente di riferimento [14,15]. Questi risultati, perfettamente in accordo con i precedenti ottenuti in vitro, rappresentano la prima evidenza sperimentale dell’influenza della radiazione ambientale in un organismo complesso, fornendo un contributo importante sia dal punto di vista radioprotezionistico che per la comprensione dell’influenza che la naturale radiazione di fondo sulla Terra ha avuto nell’evoluzione degli esseri viventi.

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Fig.2 Risultati finora ottenuti utilizzando Drosophila melanogaster come organismo modello in vivo (sintesi da Morciano et al. J. J Cell Physiol 2018; Morciano et al. Radiat Res 2018)

Per l’interpretazione dei risultati ottenuti nell’ambito degli esperimenti PULEX-COSMIC SILENCE è fondamentale una caratterizzazione dettagliata del campo di radiazioni presente nei diversi ambienti dove sono portati avanti gli esperimenti radiobiologici in vitro ed in vivo. Per questo sono in corso campagne di misure nei diversi siti di interesse, e cioè nei laboratori sotterranei ed esterni dei Laboratori Nazionali del Gran Sasso (INFN) e nei laboratori esterni all’Università degli Studi dell’Aquila e all’ISS.
Si cercherà quindi di ottenere informazioni sul ruolo delle diverse componenti del campo di radiazioni, a partire dalla componente gamma e dai prodotti di decadimento del radon ambientale, sulla risposta biologica di Drosophila melanogaster.
Dosimetri a termoluminescenza (LiF), dosimetri a luminescenza stimolata otticamente (Al2O3) e camere a ionizzazione ad alta pressione (Reuter-Stokes) sono stati scelti per misurare la dose ed il rateo di dose dovuti alla radiazione cosmica e terrestre. La presenza di Radon nell’aria è costantemente monitorata durante gli esperimenti mediante lo strumento AlphaGUARD.

A complemento di queste misure è l’approccio modellistico, che prevede simulazioni del campo di radiazione ambientale nell’ottica di arrivare ad elaborare un “dose model” per l’interpretazione dei risultati radiobiologici.
Attualmente queste attività vengono svolte nell’ambito dell’Accordo Quadro tra INFN ed ISS con riferimento alla “Convenzione operativa per attività di ricerca e sviluppo nel campo della radiobiologia”.

 

Responsabile del progetto
Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo. (Istituto Superiore di Sanità e INFN Roma 1)

Collaborazione
Istituzioni coinvolte
  1. Istituto Superiore di Sanità (Centro nazionale tecnologie innovative in sanità pubblica; Centro nazionale protezione dalle Radiazioni e fisica computazionale; Servizio grandi strumentazioni e core facility) and INFN-Sezione di Roma 1
  2. INFN - LNGS (Divisione Ricerca; Servizio di Chimica e Impianti Chimici)
  3. INFN - LNF (Servizi tecnici della Fisica Sanitaria)
  4. Department of Clinical and Biotechnological Sciences, L’Aquila University
  5. Department of Biology & Biotechnology “C. Darwin”, Section of Genetics, “La Sapienza” University, Rome
  6. Radon Laboratory of Istituto Nazionale di Metrologia delle Radiazioni Ionizzanti (INMRI) of Ente nazionale per le nuove tecnologie, l’energia e lo sviluppo economico sostenibile (ENEA)
Altre collaborazioni
  • New Mexico State University and WIPP Facility, underground repository, New Mexico, USA
  • Flinders University, Adelaide, Australia

 

Pubblicazioni selezionate

  1. Satta L, Augusti-Tocco G, Ceccarelli R, Esposito A, Fiore M, Paggi P, Poggesi I, Ricordy R, Scarsella G, Cundari E. (1995) Low environmental radiation background impairs biological defence of the yeast Saccharomyces cerevisiae to chemical radiomimetic agents. Mutat Res 347(3-4):129-33
  2. Satta L, Antonelli F, Belli M, Sapora O, Simone G, Sorrentino E, Tabocchini M A, Amicarelli F, Ara C, Cerù MP, Colafarina S, Conti Devirgiliis L, De Marco A, Balata M, Falgiani A, Nisi S. (2002) Influence of a low background radiation environment on biochemical and biological responses in V79 cells. Radiat Environ Biophys 41 (3):217-24
  3. Carbone MC, Pinto M, Antonelli F, Amicarelli F, Balata M, Belli M, Conti Devirgiliis L, Ioannucci L, Nisi S, Sapora O, et al. (2009) The Cosmic Silence Experiment: on the putative adaptive role of environmental ionizing radiation. Radiat. Environ. Biophys. 48:189-196
  4. Fratini E, Carbone C, Capece D, Esposito G, Simone G, Tabocchini MA, Tomasi M, Belli M and Satta L (2015) Low radiation environment affects the development of protection mechanisms in V79 cells. Radiation Environmental Biophysics 54(2):183-94
  5. Capece D and Fratini E (2012) The use of pKZ1 mouse chromosomal inversion assay to study
    biological effects of environmental background radiation. Phys. J. Plus 127: 37
  6. Smith GB, Grof Y, Navarrette A and Guilmette RA (2011) Exploring biological effects of low level radiation from the other side of background. Health Phys 100(3):263-265.
  7. Castillo H, Schoderbek D, Dulal S, Escobar G, Wood J, Nelson R, Smith G (2015) Stress induction in the bacteria Shewanella oneidensis and Deinococcus radiodurans in response to below-background ionizing radiation. J.Radiat Biol. 91(9): 749 –756
  8. Tabocchini MA (2015). PULEX-COSMIC SILENCE Extremely low radiation background facilities at INFN-LNGS. AIR² Bullettin, Issue 3, December 2015 (http://www.concert-h2020.eu/en/Concert_info/Access_Infrastructures)
  9. Vernì F, Cenci G (2015) The Drosophila histone variant H2A.V works in concert with HP1 to promote kinetochore-driven microtubule formation. Cell Cycle 14(4):577-88
  10. Cenci G, Ciapponi L, Marzullo M, Raffa GD, Morciano P, Raimondo D, Burla R, Saggio I, Gatti G. (2015). The analysis of pendolino (peo) mutants reveals differences in the fusigenic potential among Drosophila telomeres. PLOS Genetics 11(6):e1005260
  11. Sudmeier LJ, Howard SP, Ganetzky B.(2015) A Drosophila model to investigate the neurotoxic side effects of radiation exposure. Dis Model Mech; 8:669–77
  12. Morciano P, Zhang Y, Cenci G, Rong YS. (2013). A hypomorphic mutation reveals a stringent requirement for the ATM checkpoint protein in telomere protection during early cell division in Drosophila. G3 (Bethesda). Jun 21;3(6):1043-8.
  13. Graziadio L, Palumbo V, Cipressa F, Williams BC, Cenci G, Gatti M, Goldberg ML, Bonaccorsi S. Phenotypic characterization of diamond (dind), a Drosophila gene required for multiple aspects of cell division. Chromosoma 2018; Dec;127(4):489-504. (doi: 10.1007/s00412-018-0680-y.). [Epub 2018 Aug 18]
  14. Morciano P, Iorio R, Iovino D, Cipressa F, Esposito G, Porrazzo A, Satta L, Alesse E, Tabocchini MA, Cenci G (2018). Effects of reduced natural background radiation on Drosophila melanogaster growth and development as revealed by the FLYINGLOW program.J Cell Physiol. Jan; 233(1):23-29.
  15. Morciano P, Cipressa F, Porrazzo A, Esposito G, Tabocchini MA, Cenci G. (2018) Fruit flies provide new insights in low-radiation background biology at the INFN Underground Gran Sasso National Laboratory (LNGS). Radiat Res. Sep; 190(3):217-225.